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HUVEC细胞的提取

       脐静脉内皮细胞HUVEC的原代培养已有多年历史,学者们先后采用机械刮取、组织块移植以及酶消化法进行HUVEC细胞的培养。但是,前两种方法获得的HUVEC因混杂其他血管壁细胞且数量有限,逐渐被酶消化法替代。


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然而,实际操作中发现酶消化法仍有需注意和改良的关键因素,主要体现在以下 3 个方面:

(1)在操作技术上,因脐静脉管腔内血液需充分冲洗,且消化酶的灌注需保证其充分充盈,因此必须建立一个可以自由、方便冲洗和灌注的管道;既往主要采取一端钳夹,另一端置管后结扎的方法。但他们发现这种结扎并不牢固,易脱落,且不利于冲洗脐静脉管腔,不能使消化液充分充盈管腔。为此,他们自制了一种空针软管,将一次性静脉输液针保留前端软管套,另一端连于20 mL 注射器;实验时将其直接套入开口一端并用止血钳夹闭封口,由于软管深入管腔较长,不用结扎端口即可进行管腔冲洗,且不暴露针头,避免损伤脐静脉内壁,同时消化液灌注也保证了其充分充盈,避免了传统方法结扎后剪断一侧时血细胞混杂。以此方法他们获得了充足的无血细胞混杂的HUVEC原代细胞,这也是避免污染、保证实验成功的关键环节。

(2)在消化方法上,他们发现胰蛋白酶消化易混入成纤维细胞及平滑肌细胞,损失HUVEC,而Ⅱ型胶原酶则性质温和。实验中他们采用 0.1% Ⅱ型胶原酶,充分充盈后放入 PBS 消化,再经含 5%FBS 及 1%ECGS的内皮细胞专用培养基充分冲洗,获得的HUVEC细胞活性好,纯度达 99.56%,较既往报道的 75.52% 显著提高。

(3)培养基的选择也是必须注意的关键环节,HUVEC是一种增殖能力相对低的细胞,其对营养成分要求较高,在既往研究中多采用完全培养基(ECM培养基)添加高浓度(20%)FBS,并需添加多种细胞生长因子(如VEGF、FGF 等)。这就存在一些难以克服的问题,如由于血清浓度较高,细胞容易老化,传代的代次较少,不利于后续实验开展;由于细胞因子价格昂贵,且考虑到新鲜(2 周内)FBS 本身含有各种细胞因子,因此对于是否加用细胞因子及加用的量难以控制。因此在本实验中,他们采用SicenCell内皮细胞专用培养基(ECM培养基),其成分固定,且FBS 浓度仅为 5%,ECGS 为 1%。此时观察到原代培养的HUVEC形态较好,死细胞明显减少,细胞传代后贴壁好。

通过讨论可知,采用自制空针软管静脉注入 0.1%Ⅱ型胶原酶,使静脉充分充盈,内皮消化完全,再采用含 5%FBS 和 1%ECGS的sciencell内皮细胞专用培养基(ECM培养基),可迅速获取大量高纯度、高存活率的脐静脉内皮细胞HUVEC。培养方法简便易行,且能获得大量HUVEC,能较好地满足实验研究的需要,为组织工程血管、皮肤的制备和相关医学基础研究提供了良好HUVEC细胞来源。

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