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原代细胞的复苏步骤及注意事项

细胞一般储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。今天我们就和中乔新舟小编一起来看看原代细胞的复苏。


一、原代细胞的复苏步骤


细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态。


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1.检查

收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形,若有请立即处理告诉供应方。细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70 °C,隔夜后,移到液氮罐保存)。

2.冷冻细胞解冻

     方法一:

1、准备好37度水浴锅,预热至37度;

2、准备好T25培养瓶,加入10ml完全培养基(培养基量必须大于冻存液10倍体积);

3、取出冻存细胞管,用一次性PE手套包裹冻存管(防止管内进水导致污染),迅速放于水浴锅内,于1min内融化完全;

4、取出冻存管,酒精喷洒消毒后擦干,置于超净台内;

5、吸取冻存管内细胞悬液,加入步骤2中准备好的T25培养瓶内,8字缓慢摇匀;

6、培养瓶放于37度CO2恒温培养箱内,静置培养24h,更换新鲜换培养基(注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法)。

     方法二:

1、准备好37度水浴锅,预热至37度;

2、准备好15ml无菌离心管,加入10ml完全培养基(培养基量必须大于冻存液10倍体积);

3、准备好实验用培养板或培养器皿;

4、取出冻存细胞管,用PE手套包裹冻存管(防止管内进水导致污染),迅速放于水浴锅内,于1min内融化完全;

5、取出冻存管,酒精喷洒消毒后擦干,置于超净台内;

6、吸取冻存管内细胞悬液,加入步骤2中准备好的15ml无菌离心管,轻轻吹打混匀;

7、将离心管内细胞悬液,按实验需求接种于实验器皿内(注意接种密度不低于2×104/cm2),放于37度CO2恒温培养箱内,静置培养24h,更换新鲜换培养基(注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法)。


对于有经验的实验人员来说当然是不在话下了,但是同时如何做好细胞培养工作,细节且不可忽略。


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二、原代细胞的复苏注意事项


1.细胞复苏时要注意融化冻存细胞的应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。
2.冻存液对细胞有毒性,解冻后必须用Dhanks洗两遍才能移入培养瓶中培养。培养液中血清不能太少
3.从液氮拿出来,以最快速度丢入37度水浴,等细胞液刚刚化完取出,加培养液稀释。这样可以避免复苏过程中细胞液中有冰晶的出现,冰晶会破坏细胞膜及细胞内部结构的。
4.刚复苏的细胞还是少折腾它好,细胞37°快速解冻后直接放入预热的培养基。
5.DMSO在4度以下对细胞无毒,4度以上有毒;复苏必须尽快除去。要记得慢冻速溶
6.取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
7.常温下二甲基亚砜(DMSO)对细胞的毒副作用较大,因此,必须在1-2 min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太低,会造成细胞的损伤,所以选择40℃复苏。
8.贴壁细胞复苏实验标准流程是将解冻后的细胞悬液先进行离心,以去除冷冻保护液DMSO对细胞的损伤,但是离心也会对刚复苏的状态欠佳的细胞产生损伤。也有的实验操作是将解冻后的细胞悬液先直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。这可能使培养基中少量的DMSO对细胞造成损伤。

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