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细胞保存方法——细胞的冻存

细胞生物学研究中,为了让细胞能实现长期研究细胞生物学功能的效果,实验人员往往需要通过一些处理方式将良好状态的细胞保存起来,以备后期可以使用。


一、液氮冷冻保存法


细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。

注意:细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。


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因此,细胞冷冻技术的关键尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。通常采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂(渗透型),这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。对于一些原代细胞(皮肤细胞),除渗透型保护剂外,还会适当添加表面型保护剂(海藻糖),以提高细胞存活率。


二、 程序冻存步骤(需梯度降温)

1、 配置冻存液,冻存液推荐配比:55%(基础培养基)+40%(血清)+5%(DMSO)或90%胎牛血清+10%DMSO;推荐使用Procell通用血清型程序冻存液,货号PB180436;

2、 制备好的细胞悬液计数,计算总细胞量;

3、 细胞离心后尽量吸干净上清,离心转速1200rpm(250g)3min;

4、 加入配置好的冻存液重悬,调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL;

5、 分装入冻存管,一个冻存管分装1~1.5毫升;

6、 推荐使用程序降温盒,分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜;

7、 如没有程序降温盒,则按下列顺序依次降温:室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存,注意转移过程中要保冷,避免产生温差或冻存管融化;

8、 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。


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另中乔新舟长期供货细胞冻存液:人胚胎干细胞冻存液(定制)货号:01530163无血清细胞冻存液 货号:0143、CSP042、CSP042-100。

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