内毒素检测技术-鲎试验法

细菌内毒素，其主要成分是脂多糖（LPS），是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，内毒素对会嵌入宿主的细胞壁中。内毒素的主要毒性成分是类脂质A,当细菌在生活状态时不会释放，当细菌死亡自溶或者粘附在其他细胞时，则会表现其毒性。比如过高内毒素会导致干细胞的死亡，诱导免疫细胞释放炎症因子，引起很多细胞的状态不佳、老化甚至死亡，从而导致细胞实验的数据不准，实验不断失败。因此内毒素的检测对很多细胞实验非常重要。

一、原理

鲎是一种海洋节肢动物，鲎试剂为海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品。鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原。在适宜的条件下（温度、pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。鲎试验是目前检测内毒素最敏感的方法之一，比家兔热原试验敏感 10～100 倍,可测出小于10ng/ml的内毒素的微量内毒素。

二、试剂和器材：
1.试剂：鲎试剂、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水
2.器材：除热原吸头、稀释内毒素工作标准品用玻璃试管、漩涡混匀仪、加样枪、恒温水浴箱
注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须除热原及 无干扰 因 子 。 耐 热 器 皿 可 经 干 热 灭 菌 法（250°C干烤30min以上）去除热原。

电热恒温鼓风干燥箱

作用：干烤去热原

方式：250℃干烤30min以上。

注意事项：

(1)从温度达到250℃开始计时。

(2)干烤过程中不得开启干燥箱的门。

(3)干烤物品不要叠放不要装载过满，以免影响空气流通。

(4)设备须进行热穿透、热分布、内毒素挑战等项目的确认。

2、漩涡混合器

作用：混旋细菌内毒素

标准品，保证标准品溶液的浓度一致。

方式：

对冻干粉的细菌内毒素标准品复溶后，应混旋15min。

标准品梯度稀释过程中，每步稀释应混旋30s。

 漩涡混合后与漩涡混合前

3、试管恒温仪

作用：提供37℃恒温的环境。

方式：

对加入了内容物的鲎试剂分别放置于试管恒温仪中，37℃恒温60min±2min温育培养后，观察结果。

三、常用英文缩写：

BET：细菌内毒素检查  

BET水：细菌内毒素检查用水

MVD：供试品巨大有效稀释倍数

NC：阴性对照

MVC：供试品底线有效浓度

PC：阳性对照

λ：鲎试剂灵敏度      L：供试品细菌内毒素限值

 四、实验过程介绍：

 （一） 稀释细菌内毒素工作品

溶解：加入细菌内毒素检查用水（BET水）1ml，复溶后置旋涡混匀器上混匀15mim；

稀释：将内毒素溶液进一步用细菌毒素检查用水稀释成浓度（2λ=0.5EU/ml）。

λ为鲎试剂的灵敏度标示值，用EU/ml表示，

1 . 溶 解 ：细菌内毒素工作标准品 为 白 色 疏 松 海 绵 状 固 体 ，20EU/支。加入1ml细菌内毒素检查用水，复溶后置漩涡混匀器上混匀15min。
2.稀释：用细菌内毒素检查用水进一步稀释成浓度为4λ（1EU/ml）的内毒素工作液，
稀释时应再涡旋1min待用

方法：

1. 取鲎试剂，设四组对比；

2. 一组加入0.1ml供试品（供试品管），二组加入0.1ml BET水（阴性对照），三组加入含1ml 2λ内毒素溶液（阳性对照），四组加入含1ml 2λ内毒素的供试品（供试品管阳性对照）；

3. 每只管再加入1ml鲎试剂，混合摇匀，垂直放入37℃恒温器进行孵育；

4. 20-30分钟后观察结果。

结果：若一、二组未出现凝固，三、四组出现凝固，则供试管合格；反之，一、三、四组出现凝固，二组未出现凝固，则供试管不合格。

五、避免实验误差的注意事项

1、因微量的内毒素即可导致 LAL 凝胶化，本试验所用试管、吸管等均须预先进行去热原处理。

2、玻璃等耐热物品可干热 180 ℃ 以上 2 h 或 250 ℃ 30min，以破坏内毒素；不耐热物品可用双氧水浸泡。

3、其他：鲎试验测定内毒素虽敏感，但试验中，下列因素可影响其敏感性： 

A、LAL试剂的质量，每批试剂的敏感性可有不同，而这种差异与来源、制备方法等有关。

B、pH对LAL凝胶化有明显影响，应将pH控制在6～8内，适合pH为7.0土0.2，因此，在检测药物热原时，对偏酸或犏减药物，须先调正其pH。

C、孵育温度和时间。一般为 37 ℃，45～60min，也可孵育4～24h，延长观察时间，可增加阳性率。

五、内毒素检验的注意事项：

溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。

由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。

在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况下才能进行计算和判断。