细胞培养过程中的隐形污染（支原体）是普遍的问题，面对支原体污染带来的巨大难题，世界各国开始重视，对细胞进行了质量控制，得到了有效控制。
支原体是什么？
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。
采用常规的显微镜无法直接观察到支原体，当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。因此细胞都需要定期（如每个月）进行支原体污染的检测。
如何判断细胞是否被支原体感染？
一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前常用的检测方法有：培养法、 ELISA、直接或间接的荧光染色、PCR法等，其中，前面几种灵敏度、培养周期等都较长，对于普通养细胞的人来说不太实用。目前 PCR法灵敏度最高。且耗时较短。操作简单、可一次做多个细胞样本。
PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA 扩增实验，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA链扩增延伸。
支原体检测试剂盒图（货号：ZQ505-K）
1、Myco-PCR-Mix中加入了电泳测试时所需的色素试剂（蓝色和黄色色素），PCR 反应完毕后可以直接进行凝胶电泳，反应液呈现鲜艳的绿色。这种预混液方案操作简便，可最大限度地减少人为误差，在较短时间内即可获得检测结果。
2、本产品克服了PCR 反应配置过程中的繁琐程序，通过加入抑制非特异性结合的 cocktail，有效的整合了所有PCR反应成分，实现了一步法 PCR 技术新的突破。
3、引物
我司的引物序列通过参考文献和查阅大量信息和验证后发现相对市面上的引物，我司引物灵敏度更高。
通过对比不同品牌的支原体检测试剂盒,结果发现阳性样本在同一块胶体上是有一定差异的。阳性样本经过3、9、27倍数稀释后试剂盒A仍然能够明确的检测出来，且弱阳性条带也相对其他试剂盒更突出。
（以下是重复3上次检测后提供的参考图）
样本1为阳性样本3倍稀释、样本2为阳性9倍稀释、样本3为阳性27倍稀释、样本4为弱阳性、样本5为弱阳性、样本6为阳性对照、样本4为阴性对照性。Maker为1500bp
实验样本：
用于检测支原体的样品是接种后进行 3-6 天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基，培养上清可直接加入到 PCR 反应液中。如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取 DNA，再进行 PCR 反应。
实验步骤
反应体系： Myco-PCR-Mix 24ul
待检测细胞上清液 1ul
按照以上反应比例，在PCR管中将待检测样品上清液 1ul加入到24 Myco-PCR-Mix中，每次检测请用Positivecontrol模版作为阳性对照，用Negative control模版作为阴性对照。
PCR反应程序为：95℃ 5min，（95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s）30 个循环，72℃ 5min， 40℃ 保存。PCR产物跑1.5 % 琼脂胶，用DL2000的DNA Marker显示片段大小。
检测结果
待检测样品中如果出现与阳性对照大小一致（450-600 bp）的条带，说明样品被支原体感染。
如果您的细胞不幸感染了支原体，最最最好的处理方式是立即丢弃该细胞，并对培养箱、超净台等设施及场所进行消毒灭菌。因为支原体的传播非常隐秘，相关研究表明其甚至能通过气溶胶传播。当然，如果您的细胞非常珍贵或者不能再获得，可以尝试使用抑制支原体的药物进行处理，尝试消除支原体污染。
这个过程一般周期较长，因为使用药物处理时需配合多次大比例连续传代来提高成功率。坚持，就是胜利！
支原体清除试剂盒（货号：CSP037）
1、本试剂含有两种有效的针对支原体的抗生素，抑制或清除支原体的效果通常会更强一些，其作用机制是通过干扰核糖体转运而抑制蛋白质的合成
1、推荐使用比例为 1:200，例如 5 mL 的完全培养基加入 25 μ L 支原体抑制剂混匀；
2、弃去旧的培养基（贴壁细胞） ，用无菌的缓冲溶液将细胞清洗干净， 再加入含有支原体抑制剂的新鲜培养基；
3、根据细胞增殖情况更换含有抑制剂的培养基或传代； 一般加入抑制剂后3天左右， 会出现明显 的效果， 连续使用两周后建议用支原体检测试剂盒进行检测。若细胞污染非常严重时，需延长使用时间。
4、环境、试剂耗材等可能一直存在污染源，建议需定期进行支原体检测。
上海中乔新舟生物科技有限公司
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