bEnd.3细胞 (小鼠脑微血管内皮细胞)是从来自患有内皮瘤的小鼠脑组织中分离的内皮细胞，该细胞通过表达多瘤病毒中间T抗原的NTKmT逆转录病毒载体感染而转化。在培养时，bEnd.3细胞最常遇到的问题就是细胞形态变化和难消化。bEnd.3细胞本身生长较慢，在低密度时会呈现不规则细胞形态，高密度时则呈规则纤维状，所以若在培养过程中发现细胞形态异常，则有可能是细胞密度低，建议细胞铺满密度较高时传代。

一、细胞特性与培养价值

作为小鼠脑微血管内皮细胞系，bEND.3细胞因其稳定的屏障功能表达（如紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5）和低传代变异率，成为血脑屏障研究的首选模型。其典型特征包括：

1）梭形或多边形：在低密度培养时，bEND.3 细胞通常呈现梭形或稍长的形态，随着细胞增殖和铺展，形态趋于多边形。

2）多边形鹅卵石样排列：当细胞生长到融合状态（高密度≥80%）时，bEND.3 细胞紧密连接，形成类似“鹅卵石”状的单层结构，这是内皮细胞的典型特征。

3）细胞边界清晰：在单层培养时，细胞之间的连接较为紧密，可形成血脑屏障相关特性。

4）细胞核居中：bEND.3 细胞的细胞核一般位于中央，形态较圆，核染色质分布均匀。

5）贴壁生长：作为内皮细胞，bEND.3 细胞主要依赖贴壁培养，其形态随培养密度不同而变化。

以下是不同倍数下的细胞形态图：

中乔新舟细胞培养图4x

中乔新舟细胞培养图10x

中乔新舟细胞培养图20x

作为脑微血管内皮细胞模型的黄金标准，bEND.3细胞的稳定培养需要这些核心技巧：

二、标准化培养流程

1. 培养前准备

培养基配置

· 基础液：DMEM高糖（货号：ZQ-100）+10%胎牛血清（货号：ZQ0500）+1%双抗（货号：CSP006），或用推荐的完全培养基（货号：ZM0090），每2-3天换液（密度<80%时），预热培养基至37℃可减少细胞应激

bEnd.3细胞专用培养基已包含成分包含基础培养基、血清、双抗等细胞生长需要的其他添加物。由中乔新舟技术团队精心优化，经过长期测试，可保持细胞良好的生长状态。

· 注意：每批次血清需进行生长曲线测试（推荐接种1×10⁴/cm²，72小时应达80%汇合）

耗材处理

· 培养瓶预包被：0.1%明胶（37℃孵育1小时）可提升初期贴壁率30%

2. 复苏与传代

复苏关键步骤

① 快速水浴（37℃/60秒）至冰晶残留＜10%

② 离心（800rpm/3min）去除DMSO

③ 重悬接种密度≥5×10⁴/cm²（首次换液延至24小时后）

传代标准化

· 消化控制：0.05%胰酶室温消化45-60秒，镜下见细胞间隙扩大即终止

· 终止技巧：加入含血清培养基后静置2分钟再吹打（减少机械损伤）

· 传代比例：接种密度建议1×10⁴/cm²，1:3至1:4（维持24-36小时对数生长期），传代后6小时内避免移动培养瓶

三、典型问题与解决方案

 ‌1）细胞形态异常与分化‌

1. ‌复苏后分叉或碎片多‌

冻存/复苏损伤导致形态不规则：改用‌无血清冻存液‌减少冰晶损伤，复苏时37℃水浴时间控制在90秒内。

增加复苏后培养基血清浓度至15%-20%，缓冲细胞损伤。

2. ‌传代后形态改变‌

胰酶消化严格控制在1-2分钟‌，显微镜下80%细胞变圆立即终止（过度消化破坏细胞连接）。

传代后24小时内补充高血清培养基（15% FBS）促进贴壁修复。

2）消化与传代困难‌

1. ‌细胞难脱落‌

使用含EDTA的胰酶（0.25%胰酶+0.53mM EDTA）24，消化前用PBS充分冲洗去除血清残留。

培养超过30代后消化时间延长：分次消化（每次≤3分钟）。

2. ‌传代后生长停滞‌

排查血清活性（建议每批次预实验）或是否支原体污染

确认CO₂浓度稳定在5%，培养基pH维持在7.2-7.4。

3）出现黑色颗粒物

通常为代谢产物，需增加换液频率（48小时/次）

4）传代后贴壁延迟

可能的原因：血清批次差异或消化损伤

解决方案：接种后6小时内不移动培养瓶，可添加10μg/ml纤连蛋白

5）自发分化

表现：出现梭形细胞

解决方案：严格筛选汇合度（传代前需达90%但不超过24小时）

6）细胞突然收缩脱落

检查CO₂浓度（5%最佳）和培养基pH（7.2-7.4）

7）冻存与复苏缺陷‌

1. ‌复苏碎片过多‌

离心速度限定‌1000rpm（约150×g）5分钟‌，高速离心加剧碎片产生。

冻存细胞密度建议为1×10⁶~5×10⁶/mL。

2. ‌存活率低‌

干冰运输后需立即37℃快速复苏，延迟操作导致冰晶二次损伤。

冻存液避免含血清，改用专用无血清配方。

8）污染与培养基问题‌

1. ‌隐污染风险‌

传代时添加1%双抗（青霉素-链霉素），但连续使用不超过3代，避免掩盖污染。

2. ‌培养基失效‌

基础配方：‌DMEM＋10% FBS＋1%双抗‌，血清批次需预测试（不同批次生长差异可达30%）。

换液频率：48-72小时/次，避免代谢废物堆积。