Caco-2细胞模型是十几年来国外广泛采用的一种研究药物小肠吸收的体外模型，具有相对简单、重复性较好、应用范围较广的特点。其来源于人的直肠癌，结构和功能类似于人小肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。这些性质可以恒定维持约20天。由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。Caco-2细胞也是研究肠道屏障、药物吸收和转运机制的经典模型，但其培养过程对操作细节要求极高。一个微小的疏漏可能导致分化失败、污染或实验结果偏差。本文梳理了Caco-2细胞培养的技术，助您轻松避开“雷区”。

细胞来源

Caco-2细胞是一种人结肠腺癌细胞系，最初是从一位72岁男性患者的直肠原位癌组织中分离出来建立的。这些细胞在体外培养时，能够分化成类似小肠上皮细胞的形态，表现出微绒毛等结构，当细胞长满时，可表现出具有分化的肠上皮细胞的特征。Caco-2细胞因其与小肠上皮细胞在结构和功能上的相似性，被广泛用于模拟体内肠道吸收和转运的实验。因其在模拟人类肠道吸收和转运方面的能力，已成为研究药物代谢和口服生物利用度的重要工具。细胞表达维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白II。

中乔新舟出库图  4X   

 中乔新舟出库图10X

Caco-2细胞特性：

培养条件：RPMI-1640基础培养基（中乔新舟 货号：ZQ-200）+10%胎牛血清 (中乔新舟 货号：ZQ0500）+1%P/S（货号：CSP006）或者完全培养基（ZM0056）

Caco-2细胞专用培养基已包含成分包含基础培养基、血清、双抗等细胞生长需要的其他添加物。由中乔新舟技术团队精心优化，经过长期测试，可保持细胞良好的生长状态。

倍增时间：大约32~80小时

消化时间： 5-15 min

传代频率：1：2传代3天可再次传代

l 复苏或传代后细胞贴壁较慢，大量细胞会漂浮并存在一些碎片，最终会以岛状形态贴壁并扩散生长。为了避免干扰细胞贴壁，48小时内不要换液。

l 细胞形态不均一，有一些含有液泡的巨大细胞，该细胞培养过程中会有黑色颗粒物，属正常现象。

l 该细胞对血清质量较为敏感，我司建议您使用品牌优质胎牛血清进行培养或选择订购我司配套Caco-2完全培养液。

一、 细胞复苏与传代 

1、快速解冻，减少应激

Caco-2细胞对温度敏感，需严格遵循“37℃水浴快速解冻→逐滴添加预温培养基→低速离心去DMSO”的步骤，避免细胞膜损伤。复苏后48小时不用去动细胞。细胞会缓慢贴壁后成块状增殖生长起来。

2、传代密度与时间控制

1）传代密度：建议接种密度为2-4×10⁴ cells/cm²，密度过低会延长增殖期，密度过高易导致堆积分化异常。

2）传代间隔：通常每3-5天传代一次（80-90%融合时），因其增殖速度较慢，切勿频繁操作。

3、消化技巧

由于消化时间比较长，尽量在胰酶的作用下充分消化脱落，减少吹打对细胞带来的机械损伤。以下是我司的消化技巧：建议消化前用pbs多洗几次，约2-4次，每次3-5ml,尽量去除干净pbs后，加入2ml的0.25%胰酶（+0.02% EDTA），放入培养箱5-8min左右，从培养箱拿出，用手掌心拍打瓶尾部，观察细胞脱落情况，(没有脱落继续放入培养箱)直到显微镜下观察细胞成流沙状态脱落约80%左右，加入3-5ml完全培养基终止消化。使用巴氏吸管轻柔吹打瓶内各部位约4-6下，收集细胞悬液离心，1000转5分钟.去除上清液，细胞沉淀用手指波动弹松后加入完全培养基进行分瓶。（以上体积是T25瓶的添加量）。

二、 分化培养：

Caco-2细胞的分化培养‌主要包括将细胞培养在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上，形成连续的单层，从而模拟肠上皮屏障的功能。Caco-2细胞在标准培养条件下汇合后，会自发分化为肠上皮样细胞，具有与小肠上皮细胞相似的形态和功能‌。

分化培养的具体步骤和条件¹：

1、培养基选择‌：Caco-2细胞的分化培养通常采用5.55 mM D-葡萄糖 EMEM 作为基础培养基，并补充10%的胎牛血清（FBS）和双抗（青霉素/链霉素，P/S）以支持细胞的生长和防止污染。具体而言，5.55 mM D-葡萄糖 EMEM培养基中需加入10%的FBS和1%的P/S，以确保细胞获得足够的营养物质和生长因子，同时维持无菌的生长环境‌，在37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养‌。

2、 细胞接种‌：将Caco-2细胞接种在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上，形成单层细胞。

3、分化条件‌：细胞在特定条件下培养时，会发生分化和极化，转变为类似于排列在小肠中的肠细胞，具有肠上皮细胞样紧密连接、微绒毛、酶和转运蛋白等特性‌。

三、常见问题与解决方案

1、细胞不贴壁

当Caco-2细胞在培养基中的胎牛血清比例降至10%时，细胞的贴壁性会明显下降。为了解决这个问题，建议使用高质量的胎牛血清，并确保血清比例不低于20%。

2、细胞难以消化

Caco-2细胞的连接非常紧密，消化时间通常需要5-10分钟。在消化过程中，细胞往往难以被吹散为单个细胞，通常形成小的细胞团块即可终止消化。

3、细胞生长缓慢

Caco-2细胞的倍增时间约为72小时，传代周期较长，通常约一周传代一次。细胞贴壁和生长都较为缓慢，建议接种后等待48小时以上完成贴壁。

4、细胞老化

Caco-2细胞容易老化，表现为细胞中出现许多空泡和黑点。这可能是由于细胞裂解或污染所致。建议定期检查培养环境和条件，必要时进行传代或更换培养基。

5、支原体污染

Caco-2细胞容易受到支原体污染，表现为细胞中出现黑点或黑胶虫。这通常需要重新培养或更换培养环境。

解决方法：1）调整培养条件：确保使用高质量的胎牛血清，并调整血清比例至20%以上，以改善细胞的贴壁性。2）优化消化过程：在消化过程中分次进行，确保细胞能够被吹散为小的细胞团块即可终止消化。3）控制细胞密度和传代频率：避免频繁传代，确保细胞在80%密度时进行传代，以维持细胞的健康状态。4）定期检查培养环境和条件：定期检查培养基成分、培养环境是否出现异常，及时处理污染问题。

参考文献：

1. Harleen Kaur , Régis Moreau .mTORC1 silencing during intestinal epithelial Caco-2 cell differentiation is mediated by the activation of the AMPK/TSC2 pathway.