1、首先根据客人给出的实验基因信息,和客人协商确定条件性敲除方法。
2、根据CRISPR/Cas9系统原理,设计针对该的双侧sgRNA后,进行sgRNA质粒构建和体外转录,以及Cas9mRNA体外转录等试验。
3、利用显微操作技术,以sgRNA和Cas9mRNA为注射样本,对小鼠受精后1-细胞时期的胚胎进行胞质注射。
4、将不同样本注射后的胚胎分别培养至囊胚阶段,并进行基因型鉴定,确定所设计的sgRNA和Cas9的DNA切割效率,并最终确定使用sgRNA信息。
5、利用显微操作技术,将混合后的样品为注射样本,对小鼠受精后1-细胞时期的胚胎进行胞质注射。
并在2015年6月小鼠出生后成功进行小鼠基因型鉴定。