一、冻存时的注意事项： 

1. 在冷冻保存之前，应观察细胞生长是否良好(log phase) 且存活率高，冻存的细胞密度为80 – 90 ％为宜

2. 冷冻前检测细胞是否保有其性质，例如是否有杂细胞或者支原体等。

3. 使用的DMSO 应为试剂级等级，以5~10 ml 小体积分装，4 度避光保存，勿作多次解冻。使用的甘油也应为试剂级等级，以高压蒸汽 

     灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 

4. 冷冻保存的细胞浓度： 

4-1. 正常的成纤维细胞: 1-3x 10^6 cells/ml 

4-2 杂交瘤细胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些杂交瘤会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。 

4-3.贴壁肿瘤细胞: 1 x 10^6，依细胞种类而异。腺癌类的细胞解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。 

4-4. 悬浮细胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴类细胞须至少5 x 10^6 cells/ml。 

5. 冷冻保护剂浓度为5 %或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 

二.、冻存的步骤： 

1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 

2. 使用ScienCell冻存液（货号：0133）混合均匀，置于室温下待用。 

3. 依细胞传代培养的操作，收集培养好的细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 

4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 10^6 cells/ml，混合均匀，

     分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 

5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 度10 分钟→ -20 度 30 分钟→ -80 度16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。 

6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL 。