脐静脉内皮细胞HUVEC的原代培养已有多年历史，学者们先后采用机械刮取、组织块移植以及酶消化法进行HUVEC细胞的培养。但是，前两种方法获得的HUVEC因混杂其他血管壁细胞且数量有限，逐渐被酶消化法替代。

然而，实际操作中发现酶消化法仍有需注意和改良的关键因素，主要体现在以下 3 个方面：

（1）在操作技术上，因脐静脉管腔内血液需充分冲洗，且消化酶的灌注需保证其充分充盈，因此要建立一个可以自由、方便冲洗和灌注的管道；既往主要采取一端钳夹，另一端置管后结扎的方法。但他们发现这种结扎并不牢固，易脱落，且不利于冲洗脐静脉管腔，不能使消化液充分充盈管腔。为此，他们自制了一种空针软管，将一次性静脉输液针保留前端软管套，另一端连于20 mL 注射器；实验时将其直接套入开口一端并用止血钳夹闭封口，由于软管深入管腔较长，不用结扎端口即可进行管腔冲洗，且不暴露针头，避免损伤脐静脉内壁，同时消化液灌注也保证了其充分充盈，避免了传统方法结扎后剪断一侧时血细胞混杂。以此方法他们获得了充足的无血细胞混杂的HUVEC原代细胞，这也是避免污染、保证实验成功的关键环节。

（2）在消化方法上，他们发现胰蛋白酶消化易混入成纤维细胞及平滑肌细胞，损失HUVEC，而Ⅱ型胶原酶则性质温和。实验中他们采用 0.1% Ⅱ型胶原酶，充分充盈后放入 PBS 消化，再经含 5%FBS 及 1%ECGS的内皮细胞专用培养基充分冲洗，获得的HUVEC细胞活性好，纯度达 99.56%，较既往报道的 75.52% 显著提高。

（3）培养基的选择也是要注意的关键环节，HUVEC是一种增殖能力相对低的细胞，其对营养成分要求较高，在既往研究中多采用完全培养基（ECM培养基）添加高浓度（20%）FBS，并需添加多种细胞生长因子（如VEGF、FGF 等）。这就存在一些难以克服的问题，如由于血清浓度较高，细胞容易老化，传代的代次较少，不利于后续实验开展；由于细胞因子价格昂贵，且考虑到新鲜（2 周内）FBS 本身含有各种细胞因子，因此对于是否加用细胞因子及加用的量难以控制。因此在本实验中，他们采用SicenCell内皮细胞专用培养基（ECM培养基），其成分固定，且FBS 浓度仅为 5%，ECGS 为 1%。此时观察到原代培养的HUVEC形态较好，死细胞明显减少，细胞传代后贴壁好。

通过讨论可知，采用自制空针软管静脉注入 0.1%Ⅱ型胶原酶，使静脉充分充盈，内皮消化完全，再采用含 5%FBS 和 1%ECGS的sciencell内皮细胞专用培养基（ECM培养基），可迅速获取大量高纯度、高存活率的脐静脉内皮细胞HUVEC。培养方法简便易行，且能获得大量HUVEC，能较好地满足实验研究的需要，为组织工程血管、皮肤的制备和相关医学基础研究提供了良好HUVEC细胞来源。