细胞由来：

大鼠成骨细胞分离出来开创骨细胞主要是由里外关节软骨和脊髓中栽培基质里的间充质祖先细胞分裂而成，能非特异代谢多种多样生理活性物质，调整甚至影响骨的形成和复建全过程。成骨细胞是骨形成的主要作用细胞，承担骨基质合成、代谢和酸化。骨不断地进行着复建，骨重建全过程包含破骨细胞粘贴在旧骨地区，代谢碱性物质融解矿物，代谢胰蛋白酶消化吸收骨基质，产生骨吸收陷窝:之后，成骨细胞移行到被人体吸收位置，代谢骨基质，骨基质酸化而产生新骨:破骨与成骨全过程平衡是保持正常肌肉量的关键所在。成骨细胞塑造不仅有利于掌握骨形成体制、骨骼系统病症的分子和细胞学基本，都是药物筛选、生物技术开发与生物技术科学研究的重要途径。

 

细胞专用培养基成分：

500ml基础培养基；胎牛血清；细胞细胞生长因子；青霉素钠/氨苄青霉素水溶液

 

细胞恢复：

1.在无菌区备好15ml离心管架和T-25培养瓶分别添加5ml培养液；

2.将冻存管放进37℃恒温水浴锅中，握紧冻存管不断摇晃，直至包装物溶化。随后马上把冻存管从沙浴取出，擦拭并喷撒75%酒精，挪到无菌区；

3.小心翼翼地拆装外盖，不必遇到里边的螺牙，用移液器轻轻地吸出来细胞悬浮液，参与到备好15ml离心管架中，1000rpm离心式5min；

4.弃上清后，清泪离心管架底端分散化细胞沉积，添加适量培养液重悬细胞后转到备好T25培养瓶（提议加液量：5~7ml）；

5.轻轻地摇晃培养瓶使细胞联合分布，如有需要（可使用闷热瓶），松掉单流阀，便于气体交换。

6.将培养瓶放进CO2恒温培养箱中培养。

 

留意:1.低温冷藏的细胞非常脆弱，请把冻存管放进37℃的沙浴中解除冻结，尽早恢复细胞。2.提早室内温度加热培养液。

 

细胞传代培养：

接到细胞后，一定要对细胞培养瓶表面进行清洁，将细胞放置恒温培养箱内进行1-2小时缓存，待细胞修复基本上生长状态后，进行后续细胞试验。

 

在倒置显微镜下观查全部细胞生长情况：

（一）细胞未长到85%时，用75%乙醇喷撒全部瓶消毒处理放进微生物工作台内，严苛无菌操作原则，开启细胞培养瓶，若培养瓶上没有标明，吸掉剩下细胞培养液，只留下6-8ml细胞培养液再次塑造。

（二）细胞已爬满（达85-95%）。就可以进行传代培养，实际方法如下：

1.弃之细胞培养液，用PBS清洗1-2次；

2.添加1.0ml胰蛋白酶消化酶，37℃消化吸收(消化时间针对不同细胞及常用胰蛋白酶略有不同)，高倍显微镜观查细胞消化吸收状况，若细胞收缩变园、通透、轻轻拍打甁壁呈流砂样掉下来，则快速取回工作台，添加翻倍的细胞培养液，停止消化吸收并轻轻地吹打细胞1-2次，使之变为单细胞悬浮液；

3.将细胞搜集于离心管架中离心式1000rmp/5min，弃上清，清泪层底，将细胞弹散；

4.添加新鲜的培养液重悬细胞，开展传代培养；

5.要是没有特别提示，提议接到细胞之后的初次传代培养比例是1:2。

注：1.观查细胞相对密度用（4X目镜）低倍镜观查，便于准确判断细胞相对密度；观查细胞形状请使用（10X或20X）高倍镜观查；

2.应用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化酶;

3.瓶内运输细胞培养液不可以多次重复使用，请换新鲜的细胞培养液塑造；

4.有一些细胞贴壁不稳固，若发现贴壁细胞有掉下来，可离心式重悬后注射到原瓶里。

 

细胞冷冻保存：

1.常规方法搜集对数期的贴壁细胞或飘浮细胞于试管婴儿中。

2.依据塑造细胞的密度冻存管大小明确需要冷冻保存细胞数。

3.将需要数量的细胞混液放置离心管架中，1000rmp，5min离心式搜集塑造细胞沉积，弃之离心管架里的上层清液。

4.加入适量细胞冻存液于离心管架中，使细胞浓度值大约为5×105-1×107/ml。轻轻地搅拌细胞，做成细胞混合物。

5.将离心管架里的细胞混合物分开包装于已标识的冻存管中，建议每管1ml或1.5ml。

6.直接把分装好的细胞冻存管放进-80℃医用冷藏箱中，可长期冷冻。

7.如果要液态氮中远期储存，需先放入-80℃电冰箱一天时间，即可挪到液氮罐中保存。

8.之上冷冻保存步骤是依照无血清蛋白冻存液。