293系列细胞到货又双叒叕脱落？

别慌！3招拯救你的“玻璃心”细胞！

（中乔新舟细胞10X ）

293细胞作为贴壁细胞，但部分亚系（如293T、293F）因基因修饰或培养习惯，贴壁能力较弱。长途运输导致细胞膜损伤，贴壁不稳。发货活细胞T25瓶到货常常会出现以下情况：

一、 遇到这样该怎么处理?

1、若细胞已漂浮，别急着倒掉。

2、建议收到细胞后放培养箱静止2-4h后观察细胞是否再次恢复贴壁。

3、如果贴壁可去除培养基，轻柔pbs洗一次，加入0.25%胰酶作用2-3min镜下观察细胞变圆,手掌心拍打瓶尾震动细胞，显微镜下观察细胞成单个，就可加含10%FBS完全培养基终止消化，轻柔吹打4-6次至细胞全成单个悬浮细胞即可。12-24小时后会有90%以上细胞会贴壁。

4、如果细胞没有恢复贴壁，可以收集培养瓶内液体离心1000转5min收集细胞沉淀，接种到新培养瓶，可提高血清浓度到15%。T25培养瓶建议加7ml完全培养基。

5、必要时使用多聚赖氨酸、纤连蛋白进行包被，促进细胞的延展和贴壁。

二、消化不透彻的后果

以下是客户T25瓶细胞密度达到80%左右进行传代，1：3传代，加入1ml的0.25%胰酶，第二天的细胞结果图;

1、 图片能明显看到细胞抱团严重，延展性不好 ，这是由于细胞在消化过程中没有消化透彻，细胞脱落后没有分散成单个细胞就终止消化导致。

2、 很多老师担心细胞消化过度，损伤细胞，考虑到细胞既然都消化脱落了，那就可以终止消化了。

3、 其实胰酶是比较温和的，相对外界的一次性吸管吹打，移液枪吹打。

三、如何让您的293细胞乖乖“趴平”，状态拉满！

1、消化： 消化脱落后室温延长1-2min,手掌心拍打瓶尾观察细胞脱落情况，震动分散细胞，显微镜下观察分散情况，加含10%FBS完全培养基终止消化。（T25瓶1ml胰酶3-5ml终止液）

2、减少吹打次数：在冻存或传代过程中，细胞沉淀用手指弹松分散开再进行下一步操作，若要吹打建议用宽口移液枪头轻柔吹散，并减少次数。避免机械损伤。

3、降低胰酶浓度：若把控不好消化时间，改用低浓度胰酶（0.05%）+ EDTA，（可用0.25%胰酶+pbs稀释）消化时间控制在3-6分钟。

四、优化微环境，让细胞“稳如泰山”

1、温柔复苏，给细胞“缓冲期”

· 37℃水浴解冻后，逐滴加入预温培养基（1mL冻存液+3-5mL培养基），减少渗透压冲击。

· 1000 rpm × 5分钟，避免细胞团机械损伤。去除培养基，用手指弹松细胞团块后进行补液分瓶。

· 24小时不扰动，接种后静置培养，别手痒急着观察细胞。

2、贴壁性不好，如何改善？

· 用0.1%明胶（4h以上或过夜）或多聚赖氨酸（10 μg/mL，4h以上或过夜）预处理，增强细胞吸附。

· 优先用优质胎牛血清（FBS），批次差异大的可提前测试促贴壁效果。提高血清浓度，刺激细胞生长。

· 或可添加1-2 mM 谷氨酰胺或非必需氨基酸（NEAA），提供额外营养支持。

293细胞虽“娇气”，但只要掌握好消化技巧+温柔操作+优化环境的技巧，就能让它“稳如老狗”！赶紧试试这些方法，让你的实验不再被细胞脱落“卡脖子”！